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Small RNA測序

研究RNA功能及調控機制的有力工具

產品介紹

 

Small RNA(sRNA)在細胞內具有多種重要的調節作用,主要通過miRNA與靶mRNA特異性結合調控靶mRNA的表達,從而參與許多生命過程,如細胞增殖、 細胞凋亡、脂肪代謝和細胞分化等。Small RNA(sRNA)測序是利用illumina測序平臺檢測已知和未知miRNA的表達水平及其表達差異,結合同一樣本的轉錄組測序數據進行聯合分析,可以同時分析miRNA及其靶基因的表達情況,為研究RNA的功能及調控機制提供有力的工具。

miRNA鑒定

miRNA轉錄起始位點多位于基因間隔區、內含子以及編碼序列的反向互補序列上,其前體具有標志性的發夾結構,成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實現的。對于已知miRNA的鑒定,我們將比對上參考基因組的reads序列與已知miRNA數據庫miRBase(v22)中的成熟miRNA序列進行比對。針對miRNA的生物特征,對于未鑒定到已知miRNA的序列,百邁客利用miRDeep2軟件進行新miRNA的預測。

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基因表達水平分析

利用轉錄組數據檢測基因表達具有較高的靈敏度。通過TPM密度圖不僅可以反映單個樣品miRNA的整體表達模式和離散程度,還可以直觀的比較不同樣品的整體基因表達水平差異。

差異表達miRNA聚類分析

聚類分析用于判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式,可通過將表達模式相同或相近的基因聚集成類,從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能,同類基因可能具有相似的功能或共同參與同一代謝過程。對篩選出的差異表達miRNA做層次聚類分析,將具有相同或相似表達行為的miRNA進行聚類。

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差異miRNA靶基因注釋

生物體內,在特定條件下某些基因對應的轉錄本會形成miRNA前體,失去編碼功能,或者通過種子區域與目的基因進行互補結合,導致基因的表達受到抑制或降解,從而影響生物學表型。因此,針對miRNA的靶基因分別進行GO和KEGG注釋及富集分析,有助于深入挖掘小RNA功能。

?專業項目方案設計 深度解析數據

從選材到后續研究內容相關信息的挖掘,整個流程嚴謹進行,全程跟蹤。

  • 實驗設計

  • RNA提取

  • 建庫測序

  • 數據分析

  • 售后答疑

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成功案例

公司成立多年以來,擁有豐富的項目分析經驗,累計完成1千多個樣品的sRNA項目研究,物種涉及廣泛,包括人鼠、動物、植物常見的組織部為及細胞樣本。公司擁有 40 余項專利技術和 150 余項軟件著作權,根據項目需要選擇方案,保障結果精準。

Q1. sRNA測序對于樣本有什么要求?

答:sRNA測序產品可以對動植物、全血、細胞等組織或者核酸樣本進行測序,分析要求需要有對應物種的參考基因組,具體的送樣指導,請參考如下內容:

Q2. 如何進行動植物的miRNA的靶基因預測?

答:植物miRNA可與mRNA的編碼區完全互補配對,并通過誘導mRNA降解而發揮抑制表達的作用。動物miRNA則可與mRNA的3’UTR區部分互補配對結合,進而抑制翻譯的進行,一般的,miRNA與mRNA的配對區域位于miRNA的5’端的 2-8個堿基,稱為種子區,只要種子區能與mRNA互補配對即可發揮作用,這也是一個miNRA能夠調控數百條mRNA的原因。
我們根據已知miRNA和新預測的miRNA與對應物種的基因序列信息,植物用 TargetFinder軟件進行靶基因預測;動物用miRanda和targetscan進行靶基因預測。

Q3. 目前對于小RNA靶基因的結果驗證方法有哪些?

答:
RT-PCR對miRNA進行定量驗證;
miRNA過表達;
熒光素酶法,過表達miRNA測定靶基因表達量;把靶基因連上一個熒光素酶,如果靶基因表達量下降,可檢測到的熒光信號則減弱
降解組測序

Q4. miRNA命名規則是怎樣的?

答:
參照miRBase的命名規則:{物種名縮寫}-miR-{編號};miR-前綴后面所跟著的數字,代表命名的順序,比如,miR-124比miR-456發現得早?!癿iR-”代表成熟的miRNA、“mir-”代表pre-miRNA和pri-miRNA、“MIR”代表編碼miRNA的基因。
miRNA幾乎全是獨一的編碼順序,但對于擁有一兩個堿基不同的則會被標上字母以示,例如,miR-124a與miR-124b。 若成熟的miRNA相同,但pre-miRNA和pri-miRNA和編碼他們的基因來自于不同的基因組,則使用數字來表示,例如,mir-194-1和mir-194-2表示兩個pre-, pri-miRNA剪切后的成熟miRNA是完全相同的,但卻是兩個不同的來源。
前綴的三個字母代表了不同的種族來源,例如,hsa-miR-194代表miRNA來源于人類,oar-miR-124來源于綿羊。
對于形成pre-,pri-miRNA莖環的兩端miRNA, 通常一端在數量上遠遠超過另一端。數量優勢的一端往往稱為guide strand,而另一端被稱為passenger strand,通常被大量降解,用*號來表示,例如miR-124和miR-124*。
最新版中miRBase已經不再使用*來標記microRNA與其發夾前體互補配對位置的互補序列,而是使用“-3p”與“-5p”作為區分這兩條序列的后綴替代舊的的命名法。(參考http://www.mirbase.org/help/nomenclature.shtml)
舉例: aly-miR158b-3p, aly 代表這是Arabidopsis lyrata 物種的miRNA, -miR158b表示這是成熟的miRNA , 其中b表示還有一個miRNA序列與它相似,僅有一兩個堿基不同。 -3p 表示它從前體的3’端剪切得到。
對新預測的miRNA 我們統一用 novel_miR_{數字編號} 來命名, 如 novel_miR_4974。

Q5. 如何進行動植物的miRNA鑒定

答:
在已知miRNA鑒定方面,我們將比對到參考基因組的reads與miRBase(v22)數據庫中的已知miRNA的成熟序列及其上游2nt與下游5nt的范圍進行比對,最多允許一個錯配,這樣鑒定到的reads被認為是鑒定到的已知miRNA。
miRNA轉錄起始位點多位于基因間隔區、內含子以及編碼序列的反向互補序列上,其前體具有標志性的發夾結構,成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實現的。針對miRNA的生物特征,對于未鑒定到已知miRNA的序列,百邁客利用miRDeep2軟件進行新miRNA的預測。
我們利用miRDeep2軟件包,通過reads比對到基因組上的位置信息得到可能的前體序列,基于reads在前體序列上的分布信息(基于miRNA產生特點,mature,star,loop)及前體結構能量信息(RNAfold randfold)采用貝葉斯模型經打分最終實現新miRNA的預測。miRDeep2主要用于動物miRNA的預測,通過參數的調整及打分系統的改變也可以對植物的miRNA進行預測。

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