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全長微生物多樣性

物種水平精準研究

產品介紹

三代微生物多樣性是基于?PacBio 測序平臺,利用單分子實時測序(SMRT Cell)的方法對 marker 基因進行測序,之后通過對 CCS(Circular Consensus Sequencing)序列過濾,得到 Optimization-CCS 進行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類,并進行物種注釋及豐度分析,可以揭示樣品的物種構成; 進一步進行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等等,可以挖掘?樣品之間的差異。

目前,微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區進行的。細菌主要是基于16S區,真菌主要基于18S區或ITS區(內轉錄間區),16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的DNA序列,18S rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA(18S rRNA)的DNA序列,ITS是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA內轉錄間隔區序列。這些序列中既有保守區又有可變區,保守序列區域反映了生物物種間的親緣關系,而高變序列區域則能體現物種間的差異。由于18S rDNA在進化速率上比較保守,在系統發育研究中較適用于種級以上階元的分類。常用作微生物分類研究的ITS分為ITS1和ITS2兩種。ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間,ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。由于ITS區在核糖體RNA加工過程中被剪切掉,不發揮功能作用,在進化過程中選擇壓力較小,進化速率約為18S rDNA的10倍,屬于中度保守的區域,利用它可研究種及種以下的分類階元。另外,也可通過選擇引物同時擴增18S rDNA和ITS,通過分析18S rDNA序列,先在較高級別上確定樣品的歸屬,然后根據ITS 序列,將真菌歸類到種或亞種水平。

我們對不同類型的樣品如:土壤、糞便、腸道、水體等,隨機挑選了30個項目對其進行物種注釋率進行研發優化,目前采用優化數據庫及注釋方法的策略,將其種水平平均注釋率提升到60%+。二代注釋到屬和種的平均比例為78%和6%,相同樣品采用三代進行注釋時,屬和種水平平均注釋率為95%和60%,注釋結果提升非常明顯。

1
Subreads(passes)
2
全長系列不能分類到種水平的比例最低

測序數據量飽和度

基于PacBio SMRT單分子實時測序技術可以對DNA序列實現單分子級別的超長讀長測序,能夠輕易實現對環境樣品中rDNA/ITS/功能基因進行全長測序,不受制于短序列的局限性,提供了種甚至菌株水平的物種分辨率,更全面的解釋物種的多樣性。

統計數據結果顯示:單樣本5000條CCS即可達到飽和。

工作流程

建庫測序:

提取樣品總 DNA 后,根據 16S 全長引物 27F 和 1492R(及其他全長引物),合成帶有 Barcode 的特異引物,進行 PCR 擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫(SMRT Bell),建好的文庫先進行文庫質檢,質檢合格的文庫用 PacBio Sequel 進行測序。PacBio Sequel下機數據為 bam 格式,通過 smrtlink 分析軟件導出 CCS 文件, 根據 Barcode 序列識別不同樣品的數據并轉化為 fastq 格式數據。

生信流程:

數據預處理:將 PacBio 下機數據導出為 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具獲取)后,主要有如下3個步驟:

1)CCS識別:使用?lima v1.7.0軟件,通過barcode對CCS進行識別,得到的Barcode-CCS序列數據;

2)CCS長度過濾:使用百邁客公司自主研發的軟件,對Barcode-CCS進行過濾,得到有效序列;

3)去除嵌合體:使用?UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到 Optimization-CCS 序 列。

信息分析內容:劃分OTU、多樣性及差異性分析(具體見分析結果)。

結果展示

送樣要求

環境樣品 送樣要求 保存及運輸
普通土壤 除去土壤表層未分解的凋落物層、動植物殘體、石礫等雜質,將大塊的樣品搗碎,過2mm篩后,分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中;每管土壤含量大概0.25~0.5g,需保證送樣量在1~2g。  

 

 

樣本-80℃或液氮中長期保存,干冰運輸
根際土壤 收集植物植株,去除根部大塊土壤;搖動植株去除附著不緊密的土壤,使用無菌刷子收集根部附著緊密的土壤;隨機多點取樣5-10g,過2mm篩后,分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中;每管土壤含量大概0.25~0.5g,需保證送樣量在1~2g。
糞便 無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內部(避免表層中的腸道膜脫落細胞),外部容易污染且細菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管(無菌)或凍存管(無菌)中,每管糞便量為0.5~2g,每個樣品分裝2~3管備份。
腸道內容物 在實驗對象死亡后,無菌條件下,取出整個腸道,用無菌解剖刀切取所需腸段的,用無菌手術刀挖取內容物分裝至2mL?EP管(無菌)或凍存管(無菌)中,每管組織量為0.5~2g,每個樣品分裝2~3管備份
水體 過濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜,每個樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過濾緩慢容易堵塞時,建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜,每個樣本0.5L-1L水樣;如果水樣中不可溶解的顆粒較多,需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質濾去,再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體,每個樣本0.5L-1L水樣。
空氣 開動采樣儀(浮游細菌采集器),使被測空氣濾過凝膠膜(滅菌),空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上(過濾時間越長,收集的空氣中的灰塵越多,菌數量越多),收集完成后取下濾膜。

DNA樣本:

項目類型

濃度

總量

純度

完整性

微生物多樣性

≥10ng/μL(Qubit)

≥500ng

擴增條帶正常

主帶清晰,無降解或輕度降解

引物列表:

內容 項目 引物名稱 序列 擴增產物長度
全長 16S 全長 27F 5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′ 1.5K
1492R 5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′ 1.5K
18S全長 EukA 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′ 1.8K
EukB 5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′ 1.8K
ITS 全長 ITS1 5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 0.6-0.7K
ITS4 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 0.6-0.7K

案例展示

案例一:

Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning

發表時間:2020

合作單位:青島農業大學

發表期刊: Journal of Hazardous Materials

研究背景:戊唑醇殺菌劑是一種應用廣泛的殺菌劑,對水生生物和人類健康具有潛在威脅。微生物降解農藥是一種高效、低成本和環境友好的方法。本研究假設生物炭可能是降解戊唑醇細菌的理想載體,而固定化生物炭比自由施用的細菌可能加速戊唑醇從土壤中的去除。為了驗證這一點,我們以麥秸源生物炭為載體,利用戊唑醇降解菌WZ-2對污染土壤進行生物修復。

測序策略: Pacbio SequelII 全長16S測序

研究結論:菌株WZ-2和固定化生物炭的WZ-2加速了戊唑的降解,使戊唑在土壤中的半衰期分別從40.8天降低到18.7天和13.3天。雖然戊唑醇對土壤酶活性(脲酶、脫氫酶、轉化酶)和微生物群落結構有負面影響,但固定化生物炭的WZ-2不僅加速了戊唑醇的降解,而且恢復了土壤微生物酶活性和微生物群落組成。

參考文獻: Sun T, Miao J, Saleem M, Zhang H, Yang Y, Zhang Q. Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning.?J Hazard Mater. 2020

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生物炭固定化細菌對土壤微生物群落組成的影響
1
戊唑醇不同處理降解動力學擬合曲線

案例二:

Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks

發表時間:2021

合作單位:華南農業大學

發表期刊: Science of the Total Environment

研究背景:砷是一種重要的有害金屬,普遍存在于受污染的土壤、河流和地下水中。然而,關于三氧化二砷(ATO,砒霜)對水禽腸-肝軸的影響及其肝毒性的研究還很少。本研究探討了腸-肝軸在三氧化二砷誘導的肝毒性和腸道毒性中的作用。

測序策略:Pacbio SequelII 全長16S

測序 研究結論: ATO暴露可引起鴨腸道菌群α-多樣性顯著降低, 對照組中凸腹真桿菌、產硫球鏈菌、類腸膜魏斯氏菌和厭氧消化鏈球菌等更豐富。ATO暴露顯著降低腸道屏障相關蛋白的表達,導致腸道通透性增加和脂多糖水平升高;上調了肝臟和空腸的焦亡相關指數,并增加了促炎細胞因子的產生。進一步的機制研究表明,ATO誘導的肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。這些結果表明,ATO暴露可導致肝臟和空腸炎癥和焦亡,而間接的腸-肝軸通路可能在ATO誘導肝毒性的潛在機制中發揮重要作用。

參考文獻: Zhong G, Wan F, Lan J, et al. Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks.?Sci Total Environ. 2021

1
ATO暴露改變了鴨腸道微生物的多樣性

更多案例

樣本類型 年份 期刊 IF 合作單位 題目
土壤 2020 Journal of Hazardous Materials 10.588 青島農業大學 Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning
牛瘤胃 2020 Frontiers in microbiology 5.64 湖南農業大學 Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora
雞腸道 2021 Science of the Total Environment 6.551 華南農業大學 Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks
土壤 2021 Frontiers in Microbiology 5.64 沈陽農業大學 Influence of Peanut, Sorghum, and Soil Salinity on Microbial Community Composition in Interspecific Interaction Zone
青貯發酵 2021 Frontiers in Microbiology 5.64 湖南農業大學 Fermented Soybean Meal Replacement in the Diet of Lactating Holstein Dairy Cows: Modulated Rumen Fermentation and Ruminal Microflora
青貯發酵 2021 Food and Energy Security 5.21 中國農業大學 Microorganisms that are critical for the fermentation quality of paper mulberry silage
小鼠盲腸內容物 2021 Ecotoxicology and Environmental Safety 6.291 首都醫科大學 Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage
小鼠腸道 2021 Food & Function 5.396 福建師范大學 Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model
腸道 2021 Journal of Hazardous Materials 10.588 成都生物研究所 Animal gut microbiome mediates the effects of antibiotic pollution on an artificial freshwater system

我們的優勢

  • 1.PB全長多樣性測序基于HiFi模式對單一片段進行多輪測序的方式來提升準確性。由于Pacbio的原始錯誤為隨機錯誤,可通過獲取CCS進行自身糾正來提升數據的準確性。同一片段測序 5 次后,單一Read的準確性至少達到Q20(99%)。
  • 2.全長序列中攜帶的特征信息更多,可以支持“種”水平的分辨率;
  • 3.群落結構更準確,避免了短讀長擴增子的PCR引物選擇會影響推斷的群落準確性和某些細菌類群的敏感性;
  • 4. CCS擴增子測序模式結合DADA2軟件算法,可獲得單堿基/近零錯誤率的全長rRNA基因序列。

常見問題

全長微生物多樣性有什么優勢?

全長微生物多樣性最主要優勢為種水平注釋率高,三代測序技術可以實現多多個高變區進行測序,能夠更為準確的還原群落結構。

送樣過后整體流程是什么樣的?

收到您的樣本后跟進項目類型進行提取擴增,建庫測序到數據分析,交付原始數據和結題報告,售后服務。

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