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真核轉錄組學測序分析

產品介紹

 

二代真核轉錄組采用Illumina測序平臺,對有參、無參真核生物特定細胞在某一功能狀態下轉錄的所mRNA進行測序。在定量層面,有參可以對基因進行定量分析,無參只能對Unigene(優化的轉錄本)進行定量分析,并進行下游的差異基因分析和功能注釋等;在結構層面,有參可進行可變剪切、SNP分析、基因結構優化、新基因預測。目前已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷、藥物研發和分子育種等領域。

 

專業項目方案設計 深度解析數據

 

轉錄組可搭配任意其他產品進行多組學的分析,同時為了沖刺高分可選擇大樣本量方案進行設計。從選材到后續研究內容相關信息的挖掘,整個流程嚴謹進行,全程跟蹤。

  • 實驗設計

  • RNA提取

  • 建庫測序

  • 數據分析

  • 售后答疑

百邁客云,個性化分析全面升級!

 

可視化操作、交互性基因深度挖掘,關注哪里“點”哪里?!净静僮鳌炕蚬δ?、基因名稱、序列和ID的檢索、關鍵基因功能及通路分析、WGCNA分析等基因功能挖掘?!緜€性化挖掘】個性化差異分析方案,個性化圖表優化、共表達趨勢分析、基因結構分析。

結果展示

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數據質控

為確保Reads有足夠高的質量,將下機原始測序數據(raw reads)去掉含有帶接頭的、低質量的reads,得到clean reads,保證后續分析的準確性。測序因受測序儀本身、測序試劑、樣品等因素影響,存在一定的錯誤率。堿基測序錯誤率分布圖可以反映測序數據的質量。

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參考序列比對

將Clean Reads與參考基因組進行序列比對,獲取在參考基因組或基因上的位置信息,定位區域分為Exon(外顯子)、Intron(內含子)
和Intergenic(基因間區)。比對到參考基因組上的Reads稱為Mapped Reads,Mapped Reads占Clean Reads的百分比,可以評估所選參考基因組組裝是否能滿足信息分析的需求。

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重復相關性評估

生物學重復的相關性不僅可以檢驗生物學實驗操作的可重復性,還可以評估差異表達基因的可靠性和輔助異常樣品的篩查。

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差異表達基因分析

差異表達基因以火山圖、MA圖、韋恩圖、聚類熱圖、蛋白互作圖等形式呈現,通過火山圖(Volcano Plot)可以快速地查看基因在兩個(組)樣品中表達水平的差異,以及差異的統計學顯著性。對于有生物學重復的樣本,我們采用DEseq進行樣品組間的差異表達分析,獲得兩個生物學條件之間的差異表達基因集;對于沒有生物學重復的樣本,使用EBseq進行差異分析。篩選差異基因標準一般為:Fold Change≥2,FDR<0.01。

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差異表達基因聚類分析

聚類分析用于判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式,可通過將表達模式相同或相近的基因聚集成類,從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能,同類基因可能具有相似的功能或共同參與同一代謝過程。

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差異表達基因GO分類

差異表達基因GO注釋分類統計圖,直觀的反映出在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)
和分子功能(molecular function),所有基因和差異基因注釋GO term的個數分布??缮钊胪诰虿町惢虻墓δ芗八诘男盘柾?,篩選關注差異基因注釋情況。

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差異表達基因蛋白互作網絡

STRING收錄多個物種預測的和實驗驗證的蛋白質-蛋白質互作的數據庫,包括直接的物理互作和間接的功能相關。結合差異表達分析結果和數據庫收錄的互作關系對,構建差異表達基因互作網絡。

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測序數據組裝

對于無參轉錄組,過濾得到的高質量clean reads需通過Trinity軟件進行組裝得到轉錄本序列。轉錄本測序深度除了受測序數據量等影響,還與該轉錄本的表達豐度有關。為了使各樣品中表達豐度較低的轉錄本組裝得更完整,對于同物種的測序樣品推薦合并組裝可以間接增加測序深度,從而使轉錄結果更完整,同時也有利于后續的數據分析;而對于不同物種的樣品,由于基因組間存在差異,推薦采用分別組裝或分開分析。

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差異表達基因KEGG通路富集

差異表達基因的KEGG Pathway富集分析,系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能,把基因及表達信息作為一個整體的網絡進行研究。利用富集因子(Enrichment Factor)分析Pathway的富集程度,并利用超幾何檢驗方法計算富集顯著性。

常見問題

在轉錄組的三個重復測序中,不是所有基因的的可變剪接都會出現3次,有的出現1次或2次,這種情況如何判定該基因是否存在相應的剪接方式?

答:針對每個樣品,同一個基因的不同轉錄本會存在可變剪接,我們只是根據測序的實際數據對可變剪接進行預測,而不是進行驗證;如果要判斷是否存在相應的剪接方式,需要實驗去驗證。重復實驗存在一定的差異,會導致可變剪接的不同。

轉錄組結果與基因組比對后,沒有相應的注釋結果,我們認為是New genes。但是,在NCBI注釋后,有些基因的注釋結果顯示是參考基因組物種,這種基因還能算是new genes嗎?

答:我們分析流程中是將測序的Reads比對到參考基因組,然后進行拼接,其中一些reads比對到基因間區并且能拼接出完整的開放閱讀框,拼接出來的位于基因間區的這些基因即為新基因。預測得到的新基因才會進行功能注釋,所以注釋結果與新基因的判斷沒有關系。

生物學重復樣品中某個樣品與其他相關性不太好該怎么處理?會不會影響文章發表?

答:為了確保分析結果的準確性,老師通常會設置3個生物學重復,這樣就可能出現生物學重復中某個樣品相關性不好的情況,影響后續差異分析結果的準確性。通??蓪⒃撎幚斫M中相關性不好的樣品剔除,再進行差異分析。后期可通過RT-qPCR等試驗手段彌補生物學重復的不足,不會影響文章的發表。

如何進行數據挖掘?

答:可從所有基因,差異基因及SNP三個方面進行數據挖掘。所有基因可通過功能注釋信息,基因ID,基因名稱,序列信息幾個方面進行挖掘,同時還可以做表達基因集維恩圖,WGCNA等分析。差異基因則可通過維恩圖分析不同處理批次幾個差異組合共同的差異基因;通常表達量變化趨勢一致的基因,可能會有相似的功能,故可通過基因共表達趨勢分析來進行差異基因的深入挖掘。SNP則可通過PCA分析,系統進化樹,樣品間差異SNP篩選及目標區域SNP查詢等進行挖掘。以上這些分析均可在我公司云平臺免費完成。

KEGG通路注釋文件中,K Number Count 指的是什么?

答:?K number Count指相關的酶的數目,比如8(6)代表8個基因注釋到這個通路,涉及到這個通路的6個酶,某兩個基因(或多個)涉及到同一個酶。

測序結果中GO和KEGG富集分析所用的指標分別是KS和Q-value,一般文獻用的都是p value<0.05,我想問一下KS和Q-value要分別設置為多少?有沒有其他測序的文章用這兩個指標。

答:Go富集我們使用的是Blast2GO R包;KEGG是我們根據fisher檢驗算法自己編寫的程序。

KS<0.05,這個值和p-value的意義相同,是TopGO軟件包中的一個檢驗方法。

Q-value<0.01,這個值是對p-value值的一個校正,和FDR概念相似,是fisher檢驗中的一個檢驗方法。

測序文章一般不用這兩個指標,涉及到算法的文獻中才有。

假設有一個基因A,測序結果中有一部分reads可以比對到3‘和5’端,中間的部分沒有序列比對上,那么有什么辦法可以延伸序列鑒定到中間部分的序列。

答:(1)用實驗的方法: 針對5’端和3’端的序列來設計引物,通過PCR實驗進行延長和擴增.
(2)生信辦法: 將該基因與它的近源物種做同源,如果能找到同源基因,則將該區域的所有read比對到同源基因上,進而來確定中間部分的序列。

項目經驗豐富,碩果累累

 

公司成立多年以來,擁有豐富的項目分析經驗,據不完全統計,完成轉錄組項目10000+,完成樣本數200000+;年處理樣本數10000+;農學物種涉及糧食作物、果蔬、觀賞植物、害蟲、家禽牲畜、水產動植物等,醫學物種涉及人、鼠,研究方向包括發育調控、環境適應、突變表現、遺傳進化、疾病發生發展機制、耐藥機制和藥物的研發診斷等各種領域。我司擁有40余項專利技術和150余項軟件著作權,根據項目需要選擇方案,保障結果精準。

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