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10x Genomics單細胞轉錄組測序分析

解決單細胞分離捕獲、極低量 RNA 反轉錄擴增

產品介紹

單細胞轉錄組測序(Single cell RNA sequencing)是在單細胞水平對轉錄組進行測序的一項新技術,可以研究單個細胞內的基因表達情況,同時解決用組織樣本測序無法解決的細胞異質性難題,讓解析單個細胞的行為、機制及其與機體的關系成為了現實。

10 X Genomics單細胞轉錄組測序平臺利用微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術來實現高通量的細胞捕獲技術,能夠一次性分離、并標記500–10000個單細胞,從而獲得每個細胞的3’端的轉錄組信息。具有細胞通量高、建庫成本低、捕獲周期短等優勢。該技術主要用于細胞分型和標記因子的鑒定,從而實現對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測,此外該技術還可以預測細胞分化與研究發育軌跡,在當下疾病、免疫、腫瘤領域以及組織、器官、發育研究中發揮越來越重要的作用。

10X genomics工作原理流程

Gel Bead-In-EMulsions

10X genomics信息分析流程

單細胞測序平臺系統集成:細胞分離捕獲,微流控芯片擴增,數據分析。解決單細胞測序兩大難點:單細胞分離捕獲,極低量 RNA 反轉錄擴增。整體的項目流程從樣品接收到項 目交付如下圖:

結果展示

2
細胞分化軌跡分析示例圖
Marker gene鑒定示例圖
Marker gene鑒定示例圖
3
細胞亞群鑒定示例圖
4
tSNE降維聚類分析示例圖

常見問題

如何確定 cluster 的具體細胞類型?

1、根據已知的 marker gene 來確定: 根據之前的經驗和文獻記載,已知某一些細胞類型會特異表達一些 marker gene, 比如 T 細胞中特異表達的 CD3/CD4,B 細胞中表達的 CD19/CD20 等。

1)根據 marker gene 在 cluster 細胞中的表達情況來確定:利用 Loupe Cell Browser 或其他軟件,標記 cell 中表達 marker gene 的情況,來推測哪個 cluster 是某種細胞類型。

2)根據軟件鑒定到的差異表達基因或者 marker gene 來確定:Cell-Ranger 與 monocle2(或其他單細胞分析軟件)均提供 cluster 差異表達基因的結果,如果已知某種細胞的Marker gene,可以在差異基因列表中尋找,是否存在這些 marker gene,從而推測該cluster 是否為某種細胞類型。

2、根據基因所在功能通路確定: 不清楚具體的 marker gene,或者某些 cluster 找不到已知的 marker gene。根據cluster 中差異基因或者共表達基因所在 KEGG 和 GO 通路,推測細胞的功能。

擬時間分析有何用?

在很多生物進程中,細胞并不是全部同時處于同一個時期的。利用單細胞基因表達研究 細胞分化時,捕獲到的細胞通常處于范圍較廣的不同時期:某些細胞細胞還未開始分化,某些處于中間狀態,而另一些可能已經分化結束。所以整體看來,樣品中的各個細胞基因表達波動較大,研究起來十分復雜。擬時間分析根據基因表達量信息,計算細胞與細胞時間的距離,估算出將所有細胞排列到其擬時間進程后的總最短路徑,幫助了解樣品中細胞的種類與細胞分化的過程。

報告中 Cell-Ranger、monocle2 或其他軟件的分析結果是什么關系?

各個軟件的分析是獨立的,雖然其中的具體分析內容存在交集,比如細胞聚類,差異基因鑒定,功能注釋等,但不同軟件的算法是不一樣的,在查看結果進行后續解讀時,切記不要弄混。

Cell-Ranger 是 10x 官方提供的分析軟件,其結果主要包括在原始的網頁報告中,分析內容較少,而且可修改以及定制化分析的余地較??;monocle2 是目前主流的單細胞分析軟件包,由華盛頓大學的 Cole Trapnell(之前 TopHat 和 Cufflinks 的作者)開發,涵蓋單細胞分析中的絕大部分,腳本相對較為靈活,可根據具體的要求對參數和方法進行修改,以獲得最佳的結果;此外,還可以提供 SC3 軟件的分析,根據后續項目個性化的要求,對結果進行調整,或者重分析。

不同軟件的分析內容,結果展現形式,均存在一定的差異,具體采用哪一套分析的結果, 主要依賴客戶根據自身要求,以及結果與預期的相符合程度進行挑選。

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