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百邁客全轉錄組產品優勢

百邁客全轉錄組測序服務是一次檢測,獲得四種分子(mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA)信息,針對不同類型的RNA進行表達分析,結構研究以及全新轉錄本的發現,并結合競爭性內源RNA(ceRNA)機制,進行聯合分析,深入挖掘轉錄水平調控網絡,深度探究各類RNA分子的調控機制。分析內容如下:

導讀

circRNA在多種生理過程中發揮著重要作用,因此許多疾病與circRNA有關,特別是癌癥。前期已有大量研究發現肝細胞癌(HCC)中circRNA表達普遍下調,pre-mRNA 3′ 末端復合物參與circRNA環化并在 HCC 腫瘤發生中起重要作用。因此,本研究探索了CPSF4在circRNA 3′ 末端形成和剪切中的作用。臨床研究表明,CPSF4在HCC中表達上調,CPSF4的高表達與HCC患者的不良預后相關。機制研究表明,CPSF4導致具有多聚腺苷酸化信號序列的circRNA降低,這類circRNA的減少導致miRNA的降低并破壞了HCC中miRNA介導的基因沉默。細胞培養和異種移植小鼠模型的實驗表明,CPSF4促進HCC細胞的增殖并增強致瘤性。綜上,在HCC中CPSF4通過抑制circRNA和破壞miRNA介導的基因沉默引發癌癥。

實驗方法

材料:5位術前未經治療的HCC患者癌組織和癌旁組織樣本;TCGA數據庫數據

方法:轉錄組測序、circRNA測序、細胞遷移實驗、生存分析

研究結果

1、circRNAs在HCC組織中下調

為了探索HCC中的circRNA表達譜,本研究分析了幾個公開可用的數據,包括GSE94508、GSE97332和GSE14520,結果顯示在3個GEO數據庫中,HCC的circRNA表達水平下降。盡管通過選擇性剪接和多聚腺苷酸化導致廣泛的RNA縮短是癌癥中的常見現象,但circRNA的長度分布沒有改變,并且所有長度的circRNA表達水平都下降。PAS序列是多聚腺苷酸化剪切的核心元件,分析表明HCC組織中的circRNA無論是否含有PAS序列均顯著下調。然而,在3個GEO數據庫中,含有PAS的circRNA的平均水平顯著低于不含PAS的circRNA,這表明PAS介導的剪切在circRNA形成中起重要作用。綜上所述,HCC組織中circRNAs整體減少,PAS介導的RNA裂解可能是導致circRNA下調的原因之一。

2、CPSF4高表達與HCC患者的不良預后相關

由于CPSF4表達在HCC中顯著增加,并且其高水平表達對應于HCC中OS的最高風險,因此本研究將重點放在CPSF4上。通過比較50對配對的序列數據,發現HCC腫瘤組織中CPSF4表達水平顯著高于正常鄰近組織。來自GSE49515的微陣列數據還表明,10名HCC患者的外周血單核細胞(PBMC)樣本中的CPSF4水平顯著高于10名健康對照,這表明CPSF4可以作為HCC診斷的生物標志物(圖 1A)。Kaplan-Meier對364例患者的生存分析顯示,5 年生存率從 CPSF4低表達患者的57%±5%下降到CPSF4高表達患者的42%±5%(p < 0.01,圖 1B)。進一步的相關分析表明,CPSF4與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著相關(圖 1C)。單變量分析表明HCC患者的OS率與高CPSF4表達之間存在關聯(p < 0.01)。多變量Cox回歸分析顯示CPSF4水平(p = 0.03)是OS的獨立預后因素(圖 1D)。

通過對臨床標本的分析進一步驗證了生物信息學結果。本次檢測的5個樣本中,CPSF4的蛋白質印跡顯示,與癌旁組織相比,HCC癌組織中表達更高(圖 1E)。此外,細胞系中CPSF4的蛋白水平也顯示CPSF4在所有HCC細胞系(Hep3B、Bel7402、Huh7、HepG2和Bel7404)中均高表達,但在正常肝細胞L02中幾乎檢測不到(圖 1F)。在5個HCC細胞系中,HepG2的CPSF4表達水平最高,而Bel7402的水平最低。在Bel7402和HepG2細胞中構建了CPSF4敲低和過表達細胞,但由于Bel7402中的CPSF4表達非常低,所以無法檢測到Bel7402-KD細胞中的敲低效率;雖然HepG2中的CPSF4表達非常高,但在HepG2-OE細胞中的過表達效率也非常低。因此,大部分CPSF4 KD實驗是在HepG2細胞中完成的,而大部分CPSF4 OE實驗是在Bel7402細胞中完成的。由41對組織樣本組成的人類HCC組織微陣列的免疫組化(IHC)染色結果也證實了HCC組織中CPSF4的上調。在41個患者中,25個HCC組織表現出CPSF4高表達。相比之下,大多數癌旁組織顯示出弱或中等的CPSF4表達(圖 1G)。相關性分析還表明,CPSF4表達與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著相關(圖 1H)。

圖1 CPSF4在HCC組織中高表達,并提示HCC患者預后不良
3、CPSF4降低HCC細胞中circRNA的表達水平

由于CPSF4負責PAS剪切,因此本研究假設CPSF4的增加加速了circRNA的降解并降低了它們在HCC細胞中的水平。為了驗證這一假設,提取CPSF4-KD HepG2細胞、CPSF4-OE Bel7402細胞及其陰性對照的總RNA,并通過高通量測序進行分析。結果顯示,在CPSF4-OE細胞中檢測到下調circRNA(1058)多于上調circRNA(821),并且circRNA的平均表達水平顯著降低。相比之下,CPSF4-KD細胞中大多數circRNA(5005個circRNA中的3221個)上調,circRNA的平均表達水平顯著增加(圖2A,B)。通過生物信息學分析發現,CPSF4主要抑制外顯子circRNA,只有一小部分circRNA是內含子或內含子-外顯子circRNA。CPSF4-OE細胞和CPSF4-KD細胞中circRNA的長度分布均未改變(圖 2C),但CPSF4調節后的circRNA變化依賴于PAS。首先,在4種細胞系中,含有PAS的circRNA的表達顯著低于不含PAS的circRNA;其次,CPSF4-KD細胞含有PAS序列的circRNA明顯上調,但在沒有PAS序列的circRNA中沒有檢測到變化(圖 2D)。而在CPSF4-OE細胞中帶有或不帶有PAS序列的circRNA都減少了,推測在高表達水平CPSF4的存在下,除了6個傳統PAS序列之外的一些非特異性PAS序列也可以被剪接。

為了驗證,本研究首先從GEO數據庫中選擇了HCC組織中807個下調的circRNA(FC>2,p<0.05);然后從RNA-seq數據中篩選了1447個在CPSF4-OE細胞中下調或在CPSF4-KD細胞中上調的circRNA。這兩組數據取交集,共得到24個circRNA作為驗證的候選circRNA;結構分析表明其中16個含有PAS序列。實時PCR結果顯示,這16個circRNA中有13個在CPSF4-OE細胞中被抑制,但在CPSF4-KD細胞中被激活(圖 2E)。選擇2個帶有PAS元件的circRNA,hsa_circ_0027774 和 hsa_circ_0004913 作為CPSF4靶向的circRNA;同時,另一個廣泛研究的不含PAS元件的circRNA hsa_circ_0001946作為CPSF4非靶向circRNA。Northern blot結果表明hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913與CPSF4呈負相關,但hsa_circ_0001946在所有細胞系中保持相同水平(圖 2F)。同時構建了這三種circRNA的OE質粒并與CPSF4 OE或KD質粒共轉染,real-time PCR結果顯示帶有PAS的circRNA(hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913)與CPSF4水平呈負相關,而不含PAS的circRNA(hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913)不受CPSF4的影響(圖 2G),這說明CPSF4在轉錄后抑制了circRNA??傊?,CPSF4直接調節HCC細胞中帶有PAS元件的circRNA的表達。

圖2 CPSF4可減少HCC細胞中的circRNA生物合成
4、CPSF4介導的circRNA減少可以導致miRNA的減少并破壞miRNA介導的基因沉默

為了測試CPSF4介導的circRNA減少是否會影響miRNA的穩定性,從CPSF4-OE和CPSF-KD細胞中提取總miRNA,結果顯示CPSF4-OE細胞中miRNA(4-40 nt)和tRNA(40-80 nt)的比率降低,但在CPSF4-KD細胞中增加(圖 3A-C),這證實了CPSF4能夠減少miRNA的積累。

與其他癌癥一樣,HCC中的miRNA表達水平整體下降。大多數下調的miRNA與本研究之前篩選的807個下調的circRNA互補。選擇與hsa_circ_0004913部分互補的hsa-miR-383-5p、hsa-miR-142-5p,以及與hsa_circ_0027774部分互補的hsa-miR-450b-3p和hsa-miR-145-5p作后續分析。實時PCR顯示4種miRNA在CPSF4-KD細胞中均增加,而在CPSF4-OE細胞中減少(圖 3D)。HepG2細胞中的circRNA探針證實hsa-miR-145、hsa-miR-450b與hsa_circ_0027774結合,而hsa-miR-142、hsa-miR-383與hsa_circ_0004913結合。AGO2免疫沉淀(RIP)結果顯示hsa_circ_0004913、hsa_circ_0027774及其結合的miRNA在AGO2抗體相關復合物中特異性富集,但在對照IgG中沒有富集。在CPSF4-KD細胞中,與對照相比hsa_circ_0004913/has-miR-383和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145對增加;但在CPSF4-OE細胞中減少,這表明CPSF4介導的circRNA減少也影響了miRNA的積累。miR-383直接靶向HCC中的PARP2,而PARP2參與HCC的發展;miR-145直接靶向CDCA3,CDCA3降低了HCC患者的生存時間。熒光素酶測定證實miR-145可以沉默CDCA3的表達,miR-383可以沉默PARP2的表達。生物信息學分析顯示,PARP2的3′-UTR中有2個miR-383結合位點,CDCA3的3′-UTR 中有2個miR-145結合位點。此外,這2個基因在HCC中均過表達,并與HCC患者較短的OS相關。通過蛋白質印跡檢測,發現PARP2和CDCA3蛋白也在CPSF4-KD細胞中降低,而在CPSF4-OE細胞中增加(圖 3E)。此外,這2種蛋白的表達與HCC中CPSF4的表達呈正相關。所有這些數據都證實了CPSF4介導的circRNA減少破壞了miRNA介導的基因沉默。

 

圖3 CPSF4減少了miRNA的積累和基因沉默
5、CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用

在Bel7402和HepG2細胞中生成hsa_circ_0004913-OE細胞,然后用CPSF4質粒轉染。分別通過蛋白質印跡和實時PCR檢測每個細胞系中的CPSF4蛋白和hsa_circ_0004913表達水平(圖 4A,B)。與對照細胞相比,hsa_circ_0004913-OE細胞顯示出較慢的增殖和較低的克隆形成。然而,CPSF4的OE可以消除hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用,因為CPSF4轉染后生長速度和克隆形成能力恢復(圖 4C,D)。這些結果表明circRNA在CPSF4介導的HCC細胞腫瘤發生中的重要作用。

圖4 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用

文獻下載:

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34103682

百邁客第八屆全國功能基因組學高峰論壇

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第八屆全國功能基因組學高峰論壇將于2021年10月18-22日震撼開啟。該峰會是中國基因產業具有影響力的行業峰會之一,為展示我國功能基因組學在多組學和大數據背景下重大研究進展,促進功能基因組學各研究領域的交流與合作,加強行業信息與資源的共享以及成果轉化,特舉辦本次高峰論壇,論壇規模逾1000人,在最新高通量測序技術、多組學分析方法及生物云蓬勃發展的背景下,本屆大會將邀請各界領域領軍者共同探索功能基因組學的新技術和新思路,以及大數據時代下的功能基因組學發展方向與未來!

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