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?近日,南京農業大學園藝學院陳勁楓教授團隊在《Advanced Science》(尖端科學:2019年影響因子15.84)在線發表了研究論文“Whole-Genome Sequence of Synthesized Allopolyploids in Cucumis?Reveal Insights into the Genome Evolution of Allopolyploidization”(doi:10.1002/advs.202004222)。該研究歷經20多年,圍繞甜瓜屬人工異源四倍體新物種“金瓜”(gocumber)開展了系統深入研究,完成了世界首例人工合成異源多倍體全基因組測序,揭示并初步闡明了異源多倍化物種形成不同階段的種間雜交作用,以及亞基因組優勢形成機制等重要科學問題,對于加強植物多倍化研究及作物育種利用具有重要意義。百邁客作為合作單位共同參與本項研究。

研究背景

?黃瓜(Cucumis sativus?L.)(2n=2x=14)是世界上重要的蔬菜作物,在馴化過程中經歷了進化瓶頸,因此其遺傳基礎尤其狹窄。陳勁楓教授團隊將栽培黃瓜(Cucumis sativus?L., 2n=14)與野生酸黃瓜(C. hystrix?Chakr., 2n=24)進行種間雜交,通過胚胎拯救和染色體加倍,首創了甜瓜屬人工異源四倍體新物種“金瓜”并命名為Cucumis hytivus?Chen and Kirkbr.。金瓜具有明顯的生長力旺盛、營養價值高等優勢,同時還具有很強的環境適應性。

天然多倍體的親本基因組通常是未知的,或是在多倍體形成后已經各自進化,因而無法系統地區分由種間雜交和基因組加倍所引起的變化。因此,對具有明確遺傳背景的人工異源四倍體C.×hytivus的研究,可以解析多倍體化進程中不同過程的潛在機制,從而揭示異源多倍體在自然界和農業生產中廣泛存在的深層含義。

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材料方法

材料構建:栽培黃瓜(C.?sativus?L.;北京截頭)與野生酸黃瓜(C. hystrix?Chakr.)雜交獲得F1(C. ×hytivus);F1經染色體加倍獲得S0;在每一代中,進行個體自花授粉,混合獲得的種子,隨機選擇幾個種子并種植以同樣地方式自交產生下一代(S4-S14)。
Denovo
  1. 材料:C.×hytivus自交第14代(S14);測序:~69X PacBio+~104X Hi-C+Bionano;轉錄組輔助基因預測:Illumina RNA-Seq 及 PacBio Iso-Seq
  2. 材料:F1、S0、S4-S13 (組裝用于比較基因組分析)測序:~80X Illumina X-TEN (scaffold N50=134~226 kb;contig N50 =47~73 kb)
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研究內容

  1. 異源四倍體C.×hytivus(S14)的組裝與注釋
  2. 亞基因組優勢分析
  3. 種間雜交、基因組加倍和二倍體化
  4. 多倍體化拓寬物種遺傳基礎,增強物種適應能力
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主要研究結果

1.?異源四倍體Chytivus(S14)的組裝與注釋

作者通過PacBio+BioNano+Hi-C+Illumina共組裝獲得530.8?Mb基因組(≈67%流式評估大??;≈77% survey評估大??;比對發現未裝出的為重復序列),contig N50=6.5?Mb,并將組裝的基因組序列掛載至19條假染色體上(掛載率97.23%;定序與定向率93.33%)(表1)。通過與二倍體C.sativus (CC)和C.hystrix(HH)染色體的C01–C07和H01–H12對應,將C.×hytivus染色體命名為Chc01–Chc07和Chh01–Chh12(圖1)。

與已測序的栽培黃瓜基因組一樣,金瓜中大部分的TE為長末端重復序列。Chytivus(S14)的Chc亞基因組(SubC)含有的TEs少于二倍體C.sativus(CC)基因組,而Chh亞基因組(SubH)保持了幾乎相同的不同類型TEs的含量和比例。共預測了45687個基因,平均基因長3846bp,每個基因有5.26個外顯子。BUSCO評估結果為90.90%,CEGMA評估結果為97.82%。在CC和HH二倍體基因組中鑒定的18882個同源基因家族中,在C.×hytivus(S14)異源四倍體中也鑒定了18428個(97.60%)(圖2)。

表1 金瓜基因組組裝結果

??圖1 金瓜亞基因組間共線性(左)及亞基因組與二倍體祖先共線性(右)

??圖2 異源四倍體后基因的變化

2.?亞基因組優勢分析

作者將C.×hytivus(S14)基因組分為Chc(203.36 Mb)和Chh(287.37 Mb)兩個亞基因組,這兩個亞基因組均小于相應的CC基因組(226.21 Mb)和HH基因組(297.49 Mb),分別包含的基因也比相應的親本種少。與CC相比,在Chh亞基因組中檢測到的SVs更多,并且基因丟失更多。通過序列深度分析及同源交換(HE)分析表明,在C.×hytivus(S14)基因組中分別丟失11個CC和146個HH基因,同時更多的HH序列被CC序列替換。共線性基因對在Chytivus(S14)亞基因組中的表達結果表明,CC顯性基因的數量明顯多于HH顯性基因(圖2C)。這些結果表明Chc亞基因組可能比Chh亞基因組更占優勢。CC和Chc亞基因組的TE含量低于HH和Chh亞基因組,支持了由祖先細胞基因組中TE的差異密度驅動異源多倍體中亞基因組偏向分化的假說(TEs的失活擴散到附近的基因,TEs密度最大的同源基因組的整體表達較弱,導致基因失活和最終丟失的可能性更大)。

3.?種間雜交、基因組加倍和二倍體化

異源多倍體化過程中的三個重要階段(種間雜交、基因組加倍和二倍體化)對異源多倍體基因組的作用各不相同。

為了區分其效果,作者分別在種間雜種F1、金瓜初世代S0和其他早期世代(S4~S13)中對S14世代中預測的157個確認缺失的基因進行鑒定。結果表明,F1中有102個基因缺失,表明種間雜交事件發生后,核基因組序列立即被消除。而F1中有個別缺失的基因在S0中再次出現,表明基因組加倍在異源多倍體中的作用與種間雜交截然不同。比較DNA序列分析顯示,相對于HH的葉綠體基因組,F1、S0和S4~S13的葉綠體基因組中共有195個SNPs和100個IndDels(圖4)。其中絕大多數SNPs(73.85%)和IndDels(73%)在F1中檢測到,推測多倍體中被廣泛發現的亞基因組優勢現象在種間雜交過程中就已經基本確定了,并在后續的進化過程逐漸累積。而在二倍體化過程中,基因組的變化也主要發生在最初的幾個世代(S0~S3),之后的世代中僅觀察到零星的核序列丟失(基因丟失),并且葉綠體基因組中沒有發現新的SNPs或InDels。

六代植物(S4、S6、S8、S10、S12和S14)的減數分裂染色體行為顯示,Chc亞基因組的單價體數量和滯后頻率顯著低于Chh亞基因組。表明該異源四倍體的Chh亞基因組存在一定的不穩定性,從而表現出較高的序列丟失率。Chh基因的不穩定性可能是導致C.×hytivus育性下降的主要原因?;ǚ劭扇拘噪S著世代的增加而穩步增加,表明育性地逐步恢復(圖3a)。

圖3F1及早期世代花粉可染性研究(左)及缺失基因數(右)

?圖4 F1及早期世代葉綠體基因組SNPs(左)和InDels(右)分布

4.?多倍體化拓寬物種遺傳基礎,增強物種適應能力

人工合成的多倍體新物種金瓜不僅表現出明顯的雜種優勢(生長力旺盛、營養價值高),同時還具有很強的環境適應性,并且C.×hytivus(S14)對根結線蟲(Meloidogyne spp.)的抗性與HH相當,且高于CC。于是作者對其進行了基因序列與表達量分析,發現金瓜中保留了來自雙親的大多數重復的NBS-LRR編碼基因(攜帶核苷酸結合位點(NBS)和亮氨酸富集重復(LRR)結構的NBS-LRR類抗性基因),使其具有更強的抗病能力,比親本物種具有更強的生存力。高溫和對照條件下,C.×hytivus與其兩個二倍體親本葉片的生長、生理反應和轉錄組表達水平研究表明,主要參與光合生物的固碳、碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝相關的基因在Chytivus中顯著表達,而親本中則沒有。證實了在熱脅迫下,Chytivus葉綠素積累和光合作用的增強,進一步說明了金瓜具有耐熱性。

小結

通過多倍體途徑創制新型的高產、高效、環境友好、適應性廣的作物新品種已成為農業生產、環境保護和人類社會可持續發展的緊迫需求。本研究利用PacBio+BioNano+Hi-C+Illumina等技術完成了首個人工合成多倍體“金瓜”的染色體水平基因組組裝,并對其亞基因組進行了精確區分。揭示并初步闡明了在異源多倍化物種形成三個階段中,種間雜交的作用最為顯著,以及亞基因組優勢形成機制。金瓜不僅表現出明顯的雜種優勢(生長力旺盛、營養價值高),同時還具有很強的環境適應性,能夠在炎熱的南京越夏生長,是利用多倍體化開發作物新品種的真實范例。本研究對于加強植物多倍化研究及作物育種利用具有重要意義。
原文鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202004222?
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